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温度和二氧化碳变化对大规模培养脐带间充质干细胞的影响-bob游戏app手机端下载

[导读]探讨频繁开关bob游戏app手机端下载 培养箱引起温度和CO2浓度的变化对大规模培养脐带间充质干细胞 (UC-MSCs) 的影响。方法 取P3代UC-MSCs, 在37℃、5﹪?CO2培养条件下, 模拟操作中不同的开关培养箱次数 (每天0、5和10次) ,

目的 探讨频繁开关培养箱引起温度和CO2浓度的变化对大规模培养脐带间充质干细胞 (UC-MSCs) 的影响。方法 取P3代UC-MSCs, 在37℃、5﹪?CO2培养条件下, 模拟操作中不同的开关培养箱次数 (每天0、5和10次) , 以及每次不同的开箱时间 (1、2和3min) , 对比分析细胞生长形态和增殖数量的差异。结果 同样开箱次数, 随着每次开箱时间的增长细胞增殖速度减慢, 1、2和3min各组细胞增殖数量差异均有统计学意义 (F=265.0, P=0.000;F=1434.61, P=0.000) ;同样开箱时间条件下, 每天开箱10次组比5次组细胞增殖数减少, 差异有统计学意义 (t值为16.400, 17.280, 4.480, P均?=0.000) 。随着开箱时间的延长, 开箱次数增加, 可以明显看到细胞胞浆内出现空泡和成片死亡脱落的细胞。结论 频繁开关培养箱及开关箱时间长短均可影响脐带MSCs的增殖, 同时对细胞形态有明显影响。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是具有自我更新和多向分化潜能的非造血干细胞。近年来,干细胞广泛应用于心血管疾病、神经系统疾病、糖尿病和创伤等各种疾病的研究[1]。脐带来源广泛,取材方便,易于采集保存。脐带采集对于新生儿及产妇均无任何痛苦和不良作用,脐带来源的间充质干细胞(umbilical cord derived mesenchymal stem cells, UC-MSCs)已成为近年研究的新热点。在UC-MSCs细胞培养过程中,通过对同一根脐带分离出的脐带间充质干细胞,在不同开关箱次数情况下,P3代培养3 d,脐带间充质细胞形态观察和数量统计,相同细胞的生长速度和质量存在差异。本文主要探讨大规模培养MSCs 过程中频繁开关培养箱造成温度和CO2浓度的变化对细胞生长情况的影响,报道如下。

材料和方法

一、脐带来源

脐带取自福州总医院2009年9月至2010年9月健康足月产新生儿,病原学检查阴性,经产妇知情同意后无菌留取。

二、仪器试剂

CO2温培养箱 (日本,SANYO公司),LG-DMEM培养基  (美国,Hyclone公司) ,胎牛血清FBS (美国,Hyclone公司) ,75 cm2培养瓶 (美国,Costar公司),0.25﹪胰酶 (美国,Gibco公司) 。

三、UC-MSCs 的分离与培养

取新鲜足月产新生儿脐带,磷酸盐缓冲液 (phosphate buffer saline, PBS) 冲洗,剔除动静脉,分离出沃顿胶,0.1﹪Ⅳ胶原酶消化过夜,0.25﹪胰酶消化60 min,离心洗涤,用含10﹪胎牛血清的LG-DMEM培养基接种,培养72 h换液,以后每3 d换液1次,长到80﹪融合时,用0.25﹪胰酶消化、传代。镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面抗原。

四、开关箱实验 

取P3代细胞,以2×105/75 cm2的密度接种,分成7组,每组6瓶细胞,置于7个37℃、5﹪CO2的培养箱中培养,对照组培养过程中不开关培养箱,其它6组分别模拟培养操作中不同的开关培养箱次数(每天5次、10次),以及每次不同的开箱时间(1、2和3 min)。第4天取出,倒置显微镜下观察细胞形态及密度分布,0.25﹪胰酶消化,600×g离心5 min,重悬计数,比较细胞增殖情况。

五、统计学分析

应用统计软件SPSS 13.0进行统计分析, 对照组和实验组细胞计数结果以 x±s的形式表示,各组间差异显著性检验采用单因素方差分析(ANOVA),以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、细胞形态观察

镜下观察细胞形态和分布,对照组UC-MSCs 为梭形或不规则多边形,呈鱼群样分布,细胞大小均匀,细胞折光性强,高倍镜下,胞浆内空泡极少或未见空泡;开关培养箱组细胞大小不均,高倍镜下,细胞胞浆内空泡数量增多,随着开关箱次数增多和时间延长,细胞形态越差。(图1)

二、细胞数量比较

正常对照组细胞计数为(5.30±0.08)×106。所有实验组与正常对照组相比较,细胞增殖数量均明显减少。开关箱培养组中,相同开箱次数,随着每次开箱时间的延长细胞增殖速度减慢,不同组细胞增殖数量之间比较差异有统计学意义(F=262.50, F=1434.62, P=0.00, P=0.00);同样开箱时间条件下,每天开箱10次比5次细胞增殖数减少,具有统计学意义 (t=16.40, t=17.28, t=4.48, P=0.00, P=0.00, P=0.00);在开箱10次,每次3 min的细胞图片上明显看到细胞片状死亡脱落(倒置显微镜下×100倍)。(表1,图2, 3)



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